熒光和熒光壽命

分子包含多個(gè)單能態(tài)S0、S1、S2…和三重態(tài)T1…，每個(gè)能態(tài)都包含多個(gè)精細(xì)的能級(jí)。正常情況下，大部分電子處在*低能態(tài)即基態(tài)S0 的*低能級(jí)上，當(dāng)分子被光束照射，會(huì)吸收光子能量，電子被激發(fā)到更高的能態(tài)S1 或S2 上，在S2 能態(tài)上的電子只能存在很短暫的時(shí)間，便會(huì)通過內(nèi)轉(zhuǎn)換過程躍遷到S1 上，而S1 能態(tài)上的電子亦會(huì)在極短時(shí)間內(nèi)躍遷到S1 的*低能級(jí)上，而這些電子會(huì)存在一段時(shí)間后通過震蕩弛豫輻射躍遷到基態(tài)，這個(gè)過程會(huì) 釋放一個(gè)光子，即熒光。

此外，亦會(huì)有電子躍遷至三重態(tài)T1 上，再由T1 躍遷至基態(tài)，我們稱之為磷光。

熒光特性

研究熒光特性時(shí)，主要在以下幾方面進(jìn)行分析：激發(fā)光譜，發(fā)射光譜、熒光強(qiáng)度、偏振熒光、熒光發(fā)光量子產(chǎn)率、熒光壽命等。其中熒光壽命（Fluorescence Lifetime）是指熒光分子在激發(fā)態(tài)上存在的平均時(shí)間（納秒量級(jí)）。

熒光壽命測試

熒光壽命一般在幾納秒至幾百納秒之間，如今主要有兩類測試方法：時(shí)域測量和頻域測量時(shí)間穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)測試曲線：

1 時(shí)域測量

由一束窄脈沖將熒光分子激發(fā)至較高能態(tài)S1，接著測量熒光的發(fā)射幾率隨時(shí)間的變化。其中目前廣泛應(yīng)用的是時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)，即TCSPC(Time Correlated Single Photon Counting)

時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(TCSPC) 實(shí)現(xiàn)了從百ps-ns-us 的瞬態(tài)測試，此方法對(duì)數(shù)據(jù)的獲取完全依賴快速探測器和高速電路。用統(tǒng)計(jì)的方法計(jì)算樣品受激后發(fā)出的*一個(gè)( 也是唯一的一個(gè)) 光子與激發(fā)光之間的時(shí)間差，也就是下圖的START( 激發(fā)時(shí)刻) 與STOP( 發(fā)光時(shí)刻) 的時(shí)間差。由于對(duì)于Stop 信號(hào)的要求，所以TCSPC 一般需要高重復(fù)頻率的光源作為激發(fā)源，其重復(fù)至少要在100KHz 以上，多數(shù)的光源都會(huì)達(dá)到MHz 量級(jí)；同時(shí)，在一般情況下還要對(duì)Stop 信號(hào)做數(shù)量上的控制，做到盡量滿足在一個(gè)激發(fā)周期內(nèi)，樣品產(chǎn)生且只產(chǎn)生一個(gè)光子的有效熒光信號(hào)，避免光子對(duì)的出現(xiàn)。

2 頻域測量

對(duì)連續(xù)激發(fā)光進(jìn)行振幅調(diào)制后，分子發(fā)出的熒光強(qiáng)度也會(huì)受到振幅調(diào)制，兩個(gè)調(diào)制信號(hào)之間存在與熒光壽命相關(guān)的相位差，因此可以測量該相位差計(jì)算熒光壽命。

左圖為正弦調(diào)制激發(fā)光（綠色）頻域顯示，發(fā)射光信號(hào)（紅色）相應(yīng)的相位變化頻域顯示。

右圖為對(duì)應(yīng)不同壽命的調(diào)制和相位的頻域顯示。TM- 調(diào)制壽命，TP- 相位壽命。[1]

顯微熒光壽命成像技術(shù)（FLIM）

顯微熒光壽命成像技術(shù)（Fluorescence Lifetime ImagingMicroscopy，F(xiàn)LIM）是一種在顯微尺度下展現(xiàn)熒光壽命空間分布的技術(shù)，由于其不受樣品濃度影響，具有其他熒光成像技術(shù)無法代替的優(yōu)異性能，目前在生物醫(yī)學(xué)工程、光電半導(dǎo)體材料等領(lǐng)域是一種重要的表征測量手段。

FLIM 一般分為寬場FLIM 和激光掃描FLIM。

寬場FLIM（Wide Field FLIM,WFM）

該技術(shù)是用平行光照明并由物鏡聚焦樣品獲得熒光信號(hào)，再由一寬場相機(jī)采集熒光成像。寬場FLIM 常用于快速獲取大面積樣品成像。時(shí)域或是頻域壽命采集都可以應(yīng)用在寬場成像FLIM 上。寬場FLIM 有更高幀率和低損傷的優(yōu)勢。

2 激光掃描FLIM（Laser Scanning FLIM,LSM）

激光掃描FLIM 是針對(duì)選定區(qū)域內(nèi)的樣品逐點(diǎn)獲取其熒光衰減曲線，再經(jīng)過擬合*終合成熒光壽命圖像。相比寬場FLIM，其在空間分辨率、信噪比方面有更大的優(yōu)勢。掃描方式有兩種：一種是固定樣品，移動(dòng)激光進(jìn)行掃描，一種是固定激光，電動(dòng)位移臺(tái)帶動(dòng)樣品移動(dòng)進(jìn)行掃描。

FLIM 應(yīng)用

• 寬禁帶半導(dǎo)體如GaN、SiC 等體系的少子壽命mapping 測量
• 量子點(diǎn)如CdSe@ZnS 等用作熒光壽命成像顯微鏡探針
• 鈣鈦礦電池/LED 薄膜的組分分析、缺陷檢測
• 銅銦鎵硒CIGS，銅鋅錫硫CZTS 薄膜太陽能電池的組分、缺陷檢測
• 鑭系上轉(zhuǎn)換納米顆粒
• GaAs 或GaAsP 量子阱的載流子擴(kuò)散研究

生命科學(xué)領(lǐng)域

• 細(xì)胞體自身熒光壽命分析
• 自身熒光相對(duì)熒光標(biāo)記的有效區(qū)分
• 活細(xì)胞內(nèi)水介質(zhì)的PH 值測量
• 局部氧氣濃度測量
• 具有相同頻譜性質(zhì)的不同熒光標(biāo)記的區(qū)分
• 活細(xì)胞內(nèi)鈣濃度測量
• 時(shí)間分辨共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）：納米級(jí)尺度上的遠(yuǎn)差測量，環(huán)境敏感的FRET 探針定量測量
• 代謝成像：NAD(P)H 和FAD 胞質(zhì)體的熒光壽命成像

OmniFluo-FLIM系列顯微熒光壽命成像系統(tǒng)應(yīng)用案例

1 用熒光分子對(duì)海拉細(xì)胞進(jìn)行染色

用熒光分子轉(zhuǎn)子Bodipy-C12 對(duì)海拉細(xì)胞（宮頸癌細(xì)胞的一種） 進(jìn)行染色。

(a) 顯微熒光壽命成像圖，壽命范圍1ns（藍(lán)色）到2.5ns（紅色）；

(b) 熒光壽命直方圖，脂肪滴的短壽命約在1.6ns 附近，細(xì)胞中其他位置壽命較長，在1.8ns 附近。

用熒光分子轉(zhuǎn)子的時(shí)間分辨測量*大的好處在于熒光壽命具備足夠清晰的標(biāo)簽特性，且與熒光團(tuán)的濃度無關(guān)。[2]